捷世康生物是一家專(zhuān)注于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的“新星”企業(yè)，產(chǎn)品及代理品牌產(chǎn)品范圍涵蓋了分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)等生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域及相關(guān)實(shí)驗室消耗品
捷世康生物是一家專(zhuān)注于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的“新星”企業(yè)，產(chǎn)品及代理品牌產(chǎn)品范圍涵蓋了分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)等生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域及相關(guān)實(shí)驗室消耗品
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點(diǎn)擊次數：5359 日期：2021/7/16 10:48:49
【產(chǎn)品名稱(chēng)】
通用名稱(chēng)：口蹄疫病毒通用型檢測試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）
英文名稱(chēng)：Foot and Mouth Disease Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規格】 50T/盒
【檢驗原理】
本試劑盒針對口蹄疫病毒通用型的高度保守區域設計特異性引物和探針，在反應體系中含口蹄疫病毒通用型基因組模板的情況下，PCR反應得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過(guò)程中相應通道信號進(jìn)行實(shí)時(shí)監測和輸出，實(shí)現檢測結果的定性分析。
【主要組成成份】
| 序號 | 組成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
| A盒 | 純化柱 | 25個(gè) | 50個(gè) |
| 2ml 收集管 | 25個(gè) | 50個(gè) | |
| 裂解液（Buffer AL） | 10ml | 20 ml | |
| 洗滌液（Buffer RW） | 50ml | 100 ml | |
| Nuclease Free Water | 5 ml | 10 ml | |
| 核酸提取說(shuō)明書(shū) | 1份 | 1份 | |
| B盒 | FMDV RT-PCR反應液 | 375 μL×1管 | 750 μL×1管 |
| FMDV逆轉錄酶 | 50 μL×1管 | 100 μL×1管 | |
| FMDV Taq酶 | 75 μL×1管 | 150 μL×1管 | |
| FMDV陽(yáng)性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 | |
| FMDV陰性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 | |
| 蛋白酶K | 600μL×1管 | 1.2ml×1管 | |
| 擴增試劑盒說(shuō)明書(shū) | 1份 | 1份 |
注：陰性對照為偶蹄獸類(lèi)基因組DNA，陽(yáng)性對照為失去活性的FMDV病毒cDNA。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個(gè)月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
新鮮采集的咽拭子、皰疹液和糞便標本，并使用滅菌生理鹽水懸浮。
2.應避免標本間交叉污染。
3.標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過(guò)夜保存；如需長(cháng)期保存，標本應凍存于-80℃以下，避免反復凍融。
【檢驗方法】
1. 試劑準備（試劑準備區）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著(zhù)液體。
（2）核算當次實(shí)驗所需要的反應數（n），并根據如下表所示反應體系計算當次實(shí)驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數（1T）+陽(yáng)性對照數（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數
| 單反液配制表(每份) | RT-PCR反應液 | 15.0 μL |
| 逆轉錄酶 | 2.0 μL | |
| Taq酶 | 3.0 μL |
(3)在無(wú)菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
2.樣本準備（樣本處理區）
用提供的病毒DNA/RNA核酸提取試劑盒（A盒）提取RNA，具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉移到PCR儀器上。陰性對照和陽(yáng)性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽(yáng)性對照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉移到PCR儀器上。
4. PCR（PCR擴增區）
（1）取樣本處理區準備好的PCR反應管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設置儀器核酸擴增相關(guān)參數進(jìn)行PCR擴增。
| 反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | 通道采集 FMDV病毒熒光信號 |
| PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數 |
| 反轉錄 | 42℃：10分鐘（min） | 1 | |
| 預變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
| 預擴增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
| 55℃：40秒（s） | |||
| PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
| 55℃：40秒（s） （此階段結束時(shí)采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設置時(shí)不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽(yáng)性對照：有典型S型擴增曲線(xiàn)或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無(wú)Ct值，線(xiàn)形為直線(xiàn)或輕微斜線(xiàn)，無(wú)指數增長(cháng)期。
2.標本結果判定：
（1）陽(yáng)性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長(cháng)期。
（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內。此時(shí)應對標本進(jìn)行重復檢測，如重復實(shí)驗結果Ct值仍在35～38范圍內，有明顯指數增長(cháng)期，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。
（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無(wú)Ct值。
【檢驗結果的解釋】
| 通道及檢測結果 | 標本檢測結果解釋 |
| FAM | |
| 陽(yáng)性（＋） | 標本中檢出FMDV RNA |
| 陰性（－） | 標本中未檢出FMDV RNA |
【檢驗方法的局限性】
1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時(shí)可能會(huì )發(fā)生假陰性的結果。
2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過(guò)程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結果。
3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過(guò)程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽(yáng)性結果。
【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的最低檢出限為102 Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤5%。
【口蹄疫病毒通用型檢測試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）注意事項】
1. 整個(gè)檢測過(guò)程應嚴格按照本說(shuō)明書(shū)要求分別在試劑準備區、樣本處理區和PCR擴增區進(jìn)行操作，各區實(shí)驗服、儀器、耗材應獨立使用，不能混用；實(shí)驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區應配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作；三個(gè)區應該配有紫外線(xiàn)殺菌裝置。
2. 為避免RNA降解，樣本處理過(guò)程應在0-4℃條件下操作，且完成實(shí)驗后立即上機檢測；樣本處理過(guò)程中使用的器具耗材應經(jīng)過(guò)無(wú)核酶處理。
3. 每次實(shí)驗應該設置陰、陽(yáng)性對照。
4. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時(shí)離心。
5. 試劑盒內所配陰性和陽(yáng)性對照在第一次使用前應全部轉移至標本準備區，并單獨存放。
6. 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進(jìn)行任何標記。
7. 儀器擴增相關(guān)參數應按照本說(shuō)明書(shū)相關(guān)要求進(jìn)行設置；不同批號試劑不能混用。
8. ABI系列熒光定量PCR儀參數設置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
實(shí)驗過(guò)程中產(chǎn)品的廢棄物應該進(jìn)行無(wú)害化處理后方可丟棄。
原創(chuàng )作者：青島捷世康生物科技有限公司
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